ГОСТ 7047-55 Витамины А, С, D, В(1), В(2) и РР. Отбор проб, методы определения витаминов и испытания качества витаминных препаратов

IV. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА Д

     
(Биологический метод)

15. Предварительная обработка исследуемого объекта

а) Жидкие продукты (обогащенный витамином рыбий жир, препараты витамина в масле и в спирте). Среднюю пробу жидких продуктов разводят в растительном масле, не содержащем витамин (в подсолнечном масле). Для первого разведения берут пипеткой не менее 0,5 см. Из первого разведения приготовляют путем дальнейшего разведения раствора, предназначенные для непосредственного скармливания крысам.

б) Твердые штучные изделия (драже с витамином Д, поливитаминное драже и т.д.).

Из средней пробы берут для анализа навеску на технохимических весах в количестве 20 г для поливитаминного драже, 15 г для граммового драже и 5 г мелкого драже.

Из навески извлекают витамин Д с помощью серного эфира, используя для этого 1-й раз - 100 см, 2-й, 3-й и 4-й раз - по 50 см эфира, после чего эфир отгоняют в токе углекислоты. Сухой остаток растворяют в подсолнечном масле.

Из полученного Д-витаминного раствора приготовляют соответствующие растворы, согласно выбранным рабочим дозам.

Разводки хранят в леднике в склянках, закрытых пробками. Каждую склянку снабжают этикеткой с указанием скармливаемой дозы исследуемого препарата.

16. Подготовка крыс

а) Опыты проводятся на белых крысах массой 40-50 г; крысы каждой семьи по возможности равномерно распределяются по группам в количестве не менее 10 в каждой группе.

б) Каждую крысу взвешивают при поступлении на опыт и на 16-й день опыта; при анализе результатов взвешиваний исключаются животные, потерявшие в течение опыта в массе.

в) Каждую крысу метят путем окрашивания различных участков тела.

г) В течение опыта все крысы получают один из следующих рационов:

Составные части рациона тщательно смешивают с водой, из смеси выпекают хлеб; каждая крыса получает примерно по 20 г хлеба в день.

д) Стандартным раствором витамина Д в опытах служит раствор кальциферола в подсолнечном масле, проверенный по международному эталону.

е) Испытуемые и эталонные растворы приготовляются в четырех разведениях из расчета 3-6-9-12 ин. ед. в 0,05 см (или в 0,1 см) и скармливаются в этих дозах крысам на 1-й и 8-й день опыта.

ж) Для скармливания животным испытуемого и эталонного растворов применяют пипетку длиной 8-10 см, в которую насасывают масло и выпускают посредством находящегося на одном конце небольшого резинового баллона. Пипетку в зависимости от скармливаемой суточной дозы калибруют на 0,05 или 0,1 см весовым путем.

17. Методы определения степени рахита

а) Рентгенографический метод. Производят рентгенографическую съемку задних конечностей живых или убитых крыс; конечности при этом необходимо несколько вытягивать. Степень рахита определяют по ширине хрящевой зоны метафизов большеберцовых костей.

б) Проба на черту. При отсутствии рентгеновской установки у убитых крыс вырезают большеберцовые кости, которые после очистки от мышц помещают в 4%-ный раствор формалина на 18-24 ч. Промыв кости в течение 5-10 мин водой, их рассекают продольно по медиальной линии при помощи острого лезвия и погружают в 0,5%-ный раствор азотнокислого серебра. После этого кости выставляют на свет (солнечный или яркой электролампы) на 10-20 мин и, как только появится на поверхности разреза серая окраска средней интенсивности, быстро промывают водой и переносят в 5%-ный раствор гипосульфита на 10-15 мин; вновь быстро промывают водой. На поверхности разреза в области зоны эпифизарного окостенения на темном фоне костной ткани резко выделяется светлая полоса хряща. Степень рахита определяют по ширине этой хрящевой зоны при помощи бинокулярной лупы с рисовальным аппаратом Аббе. С каждой кости на отдельную карточку зарисовывают карандашом контуры хрящевой зоны верхнего эпифиза и производят оценку степени рахита.

18. Определение минимальной профилактической дозы. Под минимальной профилактической дозой как исследуемой пробы, так и эталона витамина Д понимается минимальное количество препарата, предохраняющее от рахита не менее 80% крыс данной группы.

Определив, какая доза исследуемой пробы эталона витамина Д соответствует минимальной профилактической, вычисляют содержание витамина Д в ин. ед. () в 1 см (или 1 г) исследуемой пробы по следующей формуле

,

где - минимальная профилактическая доза исследуемой пробы, см или г;