• Текст документа
  • Статус
  • Скан-копия
0 %
Начинаю
Завершаю
Действующий


ГОСТ 30726-2001

Группа Н09

     
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

     
     
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

     
Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

     
Food-stuffs. Methods for detection and determination of Escherichia coli


МКС 07.100.30
67.040
ОКСТУ 9109

Дата введения 2002-07-01


Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и МТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

ВНЕСЕН Госстандартом России

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование государства

Наименование национального органа по стандартизации

Азербайджанская Республика

Азгосстандарт

Республика Армения

Армгосстандарт

Беларусь

Госстандарт Республики Беларусь

Грузия

Грузстандарт

Республика Казахстан

Госстандарт Республики Казахстан

Кыргызская Республика

Кыргызстандарт

Республика Молдова

Молдовастандарт

Российская Федерация

Госстандарт России

Республика Таджикистан

Таджикгосстандарт

Туркменистан

Главгосслужба "Туркменстандартлары"

Республика Узбекистан

Узгосстандарт

Украина

Госстандарт Украины


3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. N 297-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30726-2001 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

     1 Область применения


Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Escherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 30518*.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816-2007.

2 Нормативные ссылки


В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
____________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.


ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 30519-97/Р 50480-93* Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002).

3 Сущность методов


Методы выявления и определения НВЧ E.coli основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверхности агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний E.coli.

Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

4 Отбор и подготовка проб


Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

5 Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы)


Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью ±10 мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение 900-1000ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli;

петлю бактериологическую;

поплавки (трубки Дархема);

стекла предметные по ГОСТ 9284;

термостаты с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющие поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С;

бриллиантовый зеленый;

генцианвиолет;

желчь говяжью сухую или натуральную;

магний сернокислый;

метиловый красный;

метиловый фиолетовый;

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный;

сорбит;

феноловый красный;

целлобиоза.

6 Подготовка к анализу

6.1 Приготовление растворов и реактивов

6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli этилового спирта и добавляют 200 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4±2) °С.

6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.

6.1.3 Спиртовой раствор ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli-нафтола по ГОСТ 30519.

6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3-5 г парадиметиламинобензальдегида, 10 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli концентрированной фосфорной кислоты и 50 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек - желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.

6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli: 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2 Приготовление питательных сред

6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.

6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.

6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.

6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.

6.2.7 Среда Кларка: в 1 дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1). Среду разливают по 5-6 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд.

6.2.8 Среда (типа Клиглера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.

6.2.9 Среда Козера: в 1 дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфорнокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,1) при 25 °С. Среду стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli среды добавляют 10 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 г/дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli, затем среду разливают по 6-7 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.

6.2.10 Среда Симмонса: к среде Козера перед стерилизацией добавляют 18-20 г агара. Среду после стерилизации и добавления раствора бромтимолового синего разливают по 6-7 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli в стерильные пробирки или в чашки Петри. Среду в пробирках скашивают.

Цитратный агар Симмонса выпускается промышленностью в сухом виде.

6.2.11 Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют для приготовления сухие среды промышленного производства.

Допускается сухую среду Гисса с углеводами готовить на основе сухого питательного агара: к 7,3 г сухого питательного агара прибавляют 3,65 г соответствующего углевода (глюкозы, лактозы, целлобиозы или сорбита), 0,38 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 3,65 г натрия хлористого, 0,02 г бромкрезолового пурпурового. Смесь тщательно перемешивают в фарфоровой ступке и хранят герметично закрытой в темном месте. Полученные 15 г порошка рассчитаны на приготовление 1 дмГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coliсреды. При приготовлении среды порошок тщательно размешивают в дистиллированной воде, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают по 5-6 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli в пробирки и стерилизуют при температуре (110±1) °С в течение 20 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд. Приготовленная среда имеет фиолетовый цвет.

6.2.12 Среда Эндо, сухая промышленного производства.

6.2.13 Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.

6.2.14 Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указанным на этикетках.

6.2.15 Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.

7 Проведение анализа

7.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г (смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli) продукта и выявления Е.соli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.

Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48±3) ч.

Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).

7.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленной по 6.2.12.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение (24±3) ч.

7.3 Посевы на агаризованной среде по 7.1 и 7.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для Е.соli колоний.

На среде Эндо Е.соli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.

Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ГОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.

Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36±1) °С.

7.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1,1ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli1,5х2ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli6 мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.

7.4.1 Определение образования индола

Культуру высевают в пробирку с бульоном Хоттингера, приготовленным по 6.2.5, или мясо-пептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.

Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовленных по 6.1.2. Для этого к 5 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli 24-часовой культуры добавляют 1 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.

E.coli образует индол.

7.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)

Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования посевов к 1 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coliраствора ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli-нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Проявление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию.

E.coli не образует ацетоин.

7.4.3 Определение утилизации цитрата

Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.

E.coli не утилизирует цитрат.

7.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)

Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч. К 5 смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli культуральной жидкости прибавляют 5-10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до рН ниже 5,0.

E. coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).

7.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы

Культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре (44±1) °С в течение 24 ч.

E. coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.

При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.

Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиглера.

Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.

У культур типичных для Е. соli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Е. соli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.

7.4.6 Определение образования сероводорода

Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36±1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.

Е. соli не образует сероводород.

7.4.7 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.

8 Обработка результатов анализа

8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

8.2 К бактериям Е.соli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44±1) °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для Е.соli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам Е.соli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia приведены в приложении А.

8.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены Е.соli.

8.4 НВЧ Е.соli в 1 г (смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670.

8.5 Если при подтверждении характерных колоний (при определении количества Е.соli посевом "в" или "на" агаризованные среды) в 66% случаев, то есть не менее чем в 2 из 3 колоний, подтвержден рост Е.соli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. 7.3), принадлежат к Е.соli. В остальных случаях количество Е.соli определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества Е.соli, определенного посевом в (или "на") агаризованные среды, на 1 г (смГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli) продукта проводят по ГОСТ 26670.

8.6 Результаты определения количества Е.соli и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.

ПРИЛОЖЕНИЕ А (рекомендуемое). Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(рекомендуемое)


Наименование признака

E.coli

E.vulneris

E.blattae

E.ferqusonii

E.coli, inactive

E.hermannii

Образование индола

+

-

-

+

[+]

+

Реакция с метил-рот

+

+

+

+

+

+

Реакция Фогес-Проскауэра

-

-

-

-

-

-

Утилизация цитрата

-

-

d

[-]

-

-

Образование НГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coliS

-

-

-

-

-

-

Ферментация целлобиозы

-

+

-

+

-

+

Ферментация глюкозы с образованием кислоты

+

+

+

+

+

+

Ферментация глюкозы с образованием газа

+

+

+

+

-

+

Ферментация лактозы

+

[-]

-

-

[-]

d

Ферментация сорбита

+

-

-

-

[+]

-

Образование оксидазы

-

-

-

-

-

-

Условные обозначения:

+ - 90-100% штаммов положительны;

[+] - 76-89%

"

"

- - 0-10%

"

"

[-] - 11-25%

"

"

d - 26-75%

"

"




Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
Продукты пищевые, консервы.
Методы микробиологического анализа:

Сб. ГОСТов. - М.: Стандартинформ, 2010

ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

Название документа: ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

Номер документа: 30726-2001

Вид документа: ГОСТ

Принявший орган: Госстандарт России

Статус: Действующий

Опубликован: официальное издание

Продукты пищевые, консервы. Методы микробиологического анализа: Сб. ГОСТов. - М.: Стандартинформ, 2010 год

Дата принятия: 27 июля 2001

Дата начала действия: 01 июля 2002
Дата редакции: 01 апреля 2010
ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli
Данный документ представлен в виде сканер копии, которую вы можете скачать в формате или