ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

Приложение С
(рекомендуемое)

Методы, специфические для конструкций

С.1 Метод количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 (специфический для конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени (метод 1)

C.1.1 Введение

В этом приложении приведен метод специфической амплификации и обнаружения таксон-специфического гена сои (ген лектина, le1) и ДНК, происходящей из специфической генной конструкции, присутствующей в генетически модифицированной сое линии GTS 40-3-2. Этот метод пригоден для количественного определения количества ДНК, происходящей из генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2, в соевых ингредиентах, содержащих генетически модифицированную сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready ).

Ограничения см. в С.1.7.

С.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

С.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для сертифицированных стандартных материалов (ССМ IRMM-410) [21], состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.

Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA-SE, см. таблицу C.1), состоявших из смеси стандартных материалов, тип которых упомянут выше [22]. Кроме того, были протестированы коммерчески доступные пищевые продукты [23].

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было [24], [25].

Метод был опубликован в [26].

С.1.2.2 Совместные испытания лабораторий

Пять неизвестных образцов, содержащих от 0,7% до 3% (по массе) высушенной соевой муки из сои линии GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.

Метод, специфичный для детектирования конструкции GTS 40-3-2, дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 16% до 28% (см. таблицу С.1). В ходе начальных экспериментов совместных испытаний лабораторий было определено, что 1%-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению. Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2%-ный ССМ и разбавлять его для получения раствора 1%-ной стандартной ДНК для использования при количественном определении.

Таблица C.1 - Данные валидации 35S-промотор-специфического обнаружения ГМО в 1999 г.

Для экстракции ДНК использовалась процедура, предусмотренная в [26]. 200 мг материала образца было лизировано в 1 см буфера гуанидингидрохлорид/протеиназа К (0,5 ммоль/дм; 0,8 мг/см) при температуре 56 °C в течение трех ч. После стадии обработки РНКазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 см силиконовой смолы Wizard, и смола со связанной ДНК возвращалась путем отсасывания через колонку с фильтром Wizard. После промывания изопропанолом ДНК элюировали с силиконовой смолы 10 ммоль/дм Трис-буфером рН 9,0 при температуре 70 °C. Концентрацию ДНК оценивали с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и приводили к уровню 20 мкг/см. Для последующего ПЦР-анализа 200 нг ДНК из каждого образца были проанализированы в двух независимых реакциях.

Образцы анализировались в двух повторностях.

Поскольку образцы, помеченные SA-SE, представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени [22].

Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и статистическом расчете "выбросов". Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовавшие системы LightCycler (Roche Diagnostics), были исключены еще до расчета "выбросов". Причина исключения определенных приборов для ПЦР состояла в наблюдении, что прикладной метод нуждается в тщательной адаптации и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того, который изложен в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Груббсу [27]. Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности совместного испытания лабораторий приведены в таблице C.1.

Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных коммерчески доступных образца пищевой продукции, содержавшей от 0,3% до 36% (по массе; средние значения) генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для детектирования конструкции GTS 40-3-2, показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 23% до 36% [23].

C.1.2.3 Молекулярная специфичность

C.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной, например, в GenBank, регистрационный номер AX033493.

С.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 [24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

C.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности