ГОСТ Р 53944-2010 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы микробиологического анализа

     9 Метод выявления бактерий рода Salmonella

9.1 Сущность метода

Метод основан на использовании сред обогащения с последующим выделением сальмонелл на дифференциально-диагностических средах, а также на изучении культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств культур.

9.2 Проведение анализа

25 см (г) продукта из средней пробы, с соблюдением стерильности, вносят в колбу, содержащую 225 см одной из сред обогащения (Кауфмана, магниевой, селенитовой или селенит-цистиновой накопительной), встряхивают и инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 16-20 ч. Затем проводят высев бактериологической петлей (диаметр 0,4-0,5 мм) из сред обогащения в чашки Петри с висмут-сульфитным агаром или средой Плоскирева, или агаром Левина.

Чашки Петри с посевом инкубируют при температуре (37±1)°С. Учет результатов проводят на висмут-сульфитном агаре через 48 ч, на среде Плоскирева и Левина - через 18-24 ч.

Сальмонеллы на висмут-сульфитном агаре образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией и нежные светло-зеленые колонии.

На средах Плоскирева и Эндо колонии сальмонелл прозрачные, на среде Левина - голубоватые.

При отсутствии типичных или предположительно относящихся к бактериям рода Salmonella колоний или при наличии слабого роста микробов на плотных дифференциальных средах чашки с посевами повторно инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 20-24 ч.

Затем снова определяют присутствие колоний сальмонелл. При обнаружении подозрительных на сальмонеллы колоний продолжают исследование. В противном случае работу с посевами прекращают. При наличии типичных, характерных для сальмонелл колоний, из них берут не менее трех колоний. Если имеется на одной чашке менее трех типичных колоний, то берут все выросшие подозрительные на сальмонеллы колонии для пересева в пробирки: со скошенным питательным или мясо-пептонным агаром, с мясо-пептонным бульоном, с пептонной водой и на одну из дифференциальных сред Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера.

Среды Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера засевают сначала штрихом на скошенную поверхность, а затем уколом в глубину столбика.

Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч.

Выросшие культуры с поверхности скошенного агара используют для постановки реакции агглютинации и приготовления мазков. Мазки окрашивают по Граму и микроскопируют.

При использовании в исследованиях тест-наборов для биохимической идентификации бактерий рода Salmonella окрашивание по Граму необязательно.

Посевы на мясо-пептонном бульоне и пептонной воде используют для определения способности выделенных культур образовывать сероводород и индол.

Подтверждение наличия сальмонелл в продукте дает рост на средах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера.

На средах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера оценивают окраску и газообразование. При росте сальмонелл в средах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера в малиновый цвет окрашивается столбик (за счет расщепления глюкозы), скошенная часть среды остается бледно-розовой при отсутствии расщепления лактозы, сахарозы или обоих сахаров. Газообразование устанавливают по трещинам и разрывам столбиков агара. На средах Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера образование сероводорода обнаруживают на основании почернения среды (от темной линии по месту протокола* среды до разлитого почернения всего столбика). Расщепление мочевины выявляется по восстановлению первоначального цвета (бледно-розового) столбика среды.

________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Сальмонеллы мочевину не разлагают, сероводород образуют.

При необходимости более полной биохимической характеристики культуры пересеивают на цветные среды Гисса с углеводами ("короткий пестный ряд" с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой) и определяют их способность образовывать индол и сероводород.

С этой целью суточную культуру, взятую со скошенного питательного или мясо-пептонного агара, растирают в 1,0 см физиологического раствора. Затем по две капли (0,2 см) взвеси вносят пастеровской пипеткой в среды Гисса, пептонную воду или мясо-пептонный бульон. Культуральные среды с посевами инкубируют при температуре (37±1)°С.

На средах Гисса через 24 ч термостатирования учитывают кислотообразование (среды приобретают розово-красный цвет) и газообразование (наличие пузырьков в поплавках).

Для обнаружения индола в пробирку с мясо-пептонным бульоном или пептонной водой сразу же после посева испытуемой культуры помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную насыщенным водным раствором щавелевой кислоты. Бумажку помещают таким образом, чтобы она удерживалась пробкой, но не прикасалась к среде. При наличии индола через 1-3 дня инкубирования при температуре (37±1)°С нижняя часть бумажки окрашивается в розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете. Индол можно определить и другим способом: в пробирку с суточной бульонной культурой осторожно по стенке добавляют 5-10 капель реактива Эрлиха. Перед добавлением реактива к бульону можно ввести 2 см этилового эфира. При наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо. Сальмонеллы индола не образуют.

9.3 Для биохимической идентификации бактерий рода Salmonella допускается использование экспресс тест-систем, которые представляют собой набор одноразового использования в виде планшета со стрипами, на дно лунок которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами. Проведение анализа и учет результатов проводят по инструкции производителя.

9.4 Для подтверждения принадлежности выделенных культур к бактериям рода сальмонелл проводят серологическую идентификацию с помощью реакции агглютинации.

9.4.1 Проведение реакции агглютинации

На предметное стекло помещают каплю изотонического раствора хлористого натрия и рядом каплю поливалентной агглютинирующей сальмонеллезной сыворотки.

В каждую из приготовленных капель, начиная с изотонического раствора хлористого натрия, вносят петлей часть анализируемой колонии, равномерно растирают и покачивают предметное стекло в течение 30-60 с. Стекло помещают на темный фон и через 0,5-2,0 мин просматривают с помощью лупы по ГОСТ 25706. Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.