ГОСТ Р 53944-2010 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы микробиологического анализа

     11 Метод выявления бактерий вида Staphylococcus aureus

11.1 Сущность метода

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в культуральные селективные среды, способности стафилококков расти на средах с повышенным содержанием хлористого натрия, коагулировать плазму крови кролика и образовывать кислоту из маннита и мальтозы в аэробных условиях.

11.2 Проведение анализа

Продукты в количестве 1 см (г) высевают в пробирки, содержащие по 9 см солевого бульона. Через 24 ч инкубирования при температуре (37±1)°С проводят пересев бактериологической петлей на чашки Петри с подсушенным желточно-солевым агаром. Чашки с посевами инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 18-24 ч.

Для лучшего выявления пигментов после суточной инкубации чашки с посевами выдерживают на свету при комнатной температуре 18-24 ч.

На желточно-солевом агаре колонии St. aureus имеют форму выпуклых дисков диаметром 2-4 мм желтого, белого, кремового, лимонного, золотистого цветов с ровными краями, вокруг колоний образуется радужное кольцо.

Из колоний, предположительно относящихся к St. aureus, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, гроздевидно расположенные в мазке, бактериологической петлей отсевают в чашки Петри с питательным или мясо-пептонным агаром. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 18-24 ч.

Из выросших на агаре колоний, предположительно относящихся к St. aureus, после проверки мазков на чистоту культуры под микроскопом ставят реакцию плазмокоагуляции. Для этого в две пробирки помещают по 0,5 см разведенной кроличьей плазмы. В одну пробирку вносят петлей исследуемую суточную агаровую культуру, другую пробирку оставляют незасеянной. Пробирки помещают в термостат при температуре (37±1)°С. Учет результатов проводят через 2-4 ч и пробирки оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Пробирки следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить образовавшийся сгусток.

При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный, при наклоне пробирки неподвижен;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек, при наклоне пробирки подвижен, плотная коагуляция плазмы;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка, неполная коагуляция плазмы с образованием подвижного сгустка в центре плазмы.

Все три варианта являются положительным результатом. Колонии, предположительно относящиеся к St. aureus, выросшие на желточно-солевом агаре, бактериологической петлей пересевают в чашки Петри, содержащие агаризованную среду с маннитом (или мальтозой) и индикатором феноловым красным. Посевы термостатируют при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч. При положительной реакции вокруг колонии наблюдается желтое окрашивание среды, четко контрастирующее с пурпурно-красным фоном.

11.3 Для выявления и биохимической идентификации St. aureus допускается использование коммерческих тест-систем, допущенных к применению в Российской Федерации, которые представляют собой набор одноразового использования в виде планшета со стрипами, на дно лунок которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами. Проведение анализа и учет результатов проводят по инструкции производителя.

11.4 Обработка результатов

11.4.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Наличие грамположительных гроздевидно расположенных мелких кокков в мазках из характерных колоний на желточно-солевом агаре, положительная реакция плазмокоагуляции, ферментация маннита и мальтозы с образованием кислоты свидетельствуют о выявлении в 1 см (г) продуктов St. aureus.

Результат записывают как "не обнаружены" или "обнаружены" St. aureus в 1 см (г) продукта.

11.4.2 Допускается для целей экспрессного выявления St. aureus и/или подтверждения принадлежности выделенных культур к St. aureus использование подложек или пластин в виде подготовленной тест-системы, содержащей набор питательных веществ, герметично закрытых непроницаемой мембраной; иммунохроматографических экспресс-тестов; бактериологических анализаторов, например на принципе импеданса; метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) по ГОСТ Р 52833. Проведение анализа и учет результатов с использованием таких методов проводят по инструкциям к прибору.