6.1 Экстракция
Перед отбором пробы для анализа лабораторную пробу тщательно перемешивают. 25 г пробы для анализа, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в центрифужный стакан по 5.9. В стакан добавляют 100 см
смешанного раствора фосфорной кислоты и хлористого натрия по 4.15. Содержимое стакана перемешивают с использованием миксера по 5.20. В стакан добавляют 50 см метил-третбутилового эфира по 4.22. Содержимое стакана гомогенизируют в течение 2 мин с использованием высокоскоростного блендера по 5.2, после чего центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 15300 g с применением охлаждения приблизительно до 4°С.
Верхний органический слой переносят в коническую колбу с пробкой или в мерный цилиндр. Осадок в центрифужном стакане экстрагируют новой порцией метил-третбутилового эфира объемом 50 см, при этом содержимое стакана гомогенизируют в течение 2 мин и центрифугируют, как описано выше. Органические экстракты объединяют.
Аликвоту объединенного органического экстракта объемом 75 см помещают в круглодонную колбу по 5.15 и выпаривают на ротационном испарителе по 5.10 при температуре от 35°С до 40°С до прекращения дистилляции растворителя. Остаток в круглодонной колбе растворяют описанным ниже способом для получения раствора экстрактивных веществ в смеси 15 объемных частей метанола по 4.19 и 85 объемных частей фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.14. В колбу вносят порцию метанола объемом 3 см, которой тщательно омывают внутреннюю поверхность колбы. Полученный метанольный экстракт переносят с помощью пастеровской пипетки в делительную воронку по 5.19. Процедуру ополаскивания колбы повторяют еще раз, используя новую порцию метанола объемом 3 см. Метанольные экстракты объединяют в делительной воронке. Далее в делительную воронку вносят 34 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.14, содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин.
В делительную воронку вносят 50 см гексана по 4.18, содержимое воронки аккуратно встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев нижний слой переносят в другую делительную воронку, а верхний гексановый слой отбрасывают. Данную процедуру повторяют с использованием новой порции гексана объемом 50 см. Нижний слой переносят в центрифужный стакан по 5.9 и центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 15300 g с применением охлаждения приблизительно до температуры 4°С для отделения остатка жировых веществ. Водную фазу отделяют и фильтруют в мерный цилиндр через воронку с бумажным фильтром по 5.6.
Примечание - Следует избегать перемешивания водной и органической фаз. Если полное отделение водной фазы затруднительно, отбирают пипеткой и фильтруют не менее 35 см водной фазы.
6.2 Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом
Иммуноаффинную колонку по 4.26 подсоединяют к вакуумному манифолду по 5.5. К колонке присоединяют резервуар вместимостью 50 см или 20 см по 5.11.
Перед кондиционированием колонку выдерживают до достижения ею комнатной температуры. Для кондиционирования в резервуар, присоединенный к верхнему концу колонки, вносят 20 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.14 и дают ему протечь через колонку под действием силы тяжести со скоростью от 2 до 3 см/мин. Следует принять меры к тому, чтобы небольшое количество раствора (около 0,5 см) осталось над колонкой до момента внесения раствора пробы.
Аликвоту экстракта, полученного по 6.1, объемом 30 см вносят в резервуар и пропускают через иммуноаффинную колонку. Скорость протока при этом не должна превышать 3 см/мин. Экстракт пропускают под действием силы тяжести, либо создавая небольшое давление с помощью шприца, либо с применением небольшого разрежения.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - При использовании вакуумного манифолда следует обращать особое внимание на предотвращение возрастания скорости протока через колонку до величины, при которой возможны потери определяемого вещества.
6.3 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа
Колонку промывают, пропуская через нее 10 см воды. Далее отсоединяют резервуар и удаляют остаток воды на внутренней поверхности верхней части колонки с помощью фильтровальной бумаги или жгута из хлопковой ваты. Затем из колонки удаляют воду с помощью вакуума или путем продувания через нее воздуха шприцем в течение 1 мин.
К колонке присоединяют резервуар по 5.11 вместимостью 5 см и проводят элюирование охратоксина A по следующей двухступенчатой процедуре:
- в резервуар вносят 4 см метанола и дают ему протечь через колонку. При появлении первой капли элюата закрывают запорный кран. По истечении 1 мин открывают кран и медленно элюируют охратоксин A в стеклянную пробирку;
- собирают элюат, элюирование заканчивают продуванием колонки воздухом до полного удаления из нее растворителя. Элюат выпаривают досуха в слабом токе азота (например, при давлении от 0,7 до 1,0 бар) при нагревании на водяной бане при температуре около 45°С. Остаток после выпаривания растворяют в 300 мм смеси метанола и уксусной кислоты по 4.21. Полученный раствор пробы переносят в стеклянный сосуд по 5.18 или, если предполагается немедленное проведение ВЭЖХ-анализа, непосредственно в сосуд автосамплера.
6.4 Приготовление раствора пробы с добавкой аналита для контроля полноты обнаружения
Порцию холостой пробы продукта для детского питания массой 25 г, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают в центрифужный стакан по 5.9. На поверхность пробы наносят 40 мм раствора охратоксина A по 4.30, после чего пробу выдерживают в вытяжном шкафу не менее 2 ч для удаления растворителя. Дальнейшие операции проводят в соответствии с 6.1.
