4.1 Общие положения
Качественный анализ представляет собой специфическое определение целевых последовательностей нуклеиновой кислоты в анализируемых образцах. Каждый метод должен быть специфичен для целевой последовательности.
Качественный анализ должен четко показывать наличие или отсутствие исследуемого генетического элемента с учетом соответствующих контролей.
Примечание - Пределы обнаружения используемого метода анализа и размер анализируемой части образца представляют собой критические аспекты метода.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2 ПЦР-амплификация
Амплификация целевой последовательности ДНК производится in vitro посредством реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, в присутствии олигонуклеотидов-праймеров и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в заданном реакционном буфере [1], [2]. Необходимым условием для проведения амплификации целевой последовательности является отсутствие ингибиторов полимеразы в реакционной смеси. Амплификация ДНК - это циклический процесс, состоящий из следующих этапов:
- денатурация двухнитевой ДНК в однонитевую нуклеиновую кислоту посредством нагрева;
- отжиг (специфическая гибридизация) праймеров к целевой последовательности при соответствующей температуре и
- элонгация праймеров, связанных с обеими одинарными спиралями, ДНК-полимеразой, применимой в ПЦР, при соответствующей температуре.
4.3 Обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР
Обнаружение продуктов ПЦР производится с помощью электрофореза в агарозном геле или при необходимости альтернативными доступными методами после изоляции посредством соответствующей процедуры разделения.
Идентификация любой обнаруженной целевой последовательности может быть подтверждена соответствующей методикой (например, с помощью рестрикционного анализа ферментами рестрикции, гибридизации или анализа последовательности ДНК).
В случае использования анализа ПЦР в реальном времени амплификация и детектирование происходят одновременно.