МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах

УТВЕРЖДАЮ Начальник Управления ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству В.А.Апалькин 3 октября 2005 г. N 5-1-14/971

РАЗРАБОТЧИКИ: д.в.н., профессор Каврук Л.С. (Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии); д.в.н., профессор Шумилов К.В., к.б.н., с.н.с. Мельниченко Л.П.; к.в.н., с.н.с. Скляров О.Д., д.б.н., профессор Обухов И.Л. (ФГУ "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов"); д.м.н., профессор Смирнов И.В. (ЗАО "Инфамед"); д.м.н., профессор Зыкин Л.Ф., д.б.н., профессор Щербаков А.А. (Саратовский государственный аграрный университет им.Н.И.Вавилова).

     1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Иерсиниоз - острое инфекционное заболевание людей и животных разных видов, включая птиц. Возбудителями болезни являются патогенные штаммы Yersinia enterocolitica, относящиеся к роду Yersinia, семейству Enterobacteriaceae.

1.2. Бактерии вида Y. enterocolitica широко распространены в природе ввиду высокой адаптации к сапрофитному образу жизни, что является одной из характерных биологических особенностей данного вида бактерий. Наряду с сапрофитными свойствами многие штаммы иерсиний проявляют патогенные свойства за счет токсигенности, адгезивности, инвазивности и способности противостоять фагоцитозу в организме теплокровных животных. Резервуаром возбудителя иерсиниоза помимо больных животных являются объекты окружающей среды - вода, почва, растительные корма, пищевые продукты, особенно молоко.

Большую роль в распространении возбудителя иерсиниоза играют синантропные грызуны (серые крысы, мыши), в связи с тем, что с их экскрементами иерсинии часто попадают на овощи в период хранения.

Температура от +4 до +40°С является благоприятной для размножения Y. enterocolitica, что способствует накоплению иерсиний на объектах животноводческих помещений - стойл, полов, подстилке, навозной жиже, овощехранилищах и пр.

1.3. Иерсиниоз чаще протекает в кишечной форме, но иногда развивается бактериемия с поражением различных внутренних органов. В зависимости от продолжительности болезни она может иметь острое и подострое течение.

Заболеванию особенно подвержен молодняк, у которого иерсиниоз проявляется в виде спорадических случаев или энзоотической вспышки, чему способствуют многие факторы, связанные с несоблюдением технологических, ветеринарно-санитарных, зоогигиенических и общих противоэпизоотических требований при его выращивании.

Клиническая картина болезни не имеет специфических особенностей и характеризуется признаками, свойственными кишечным инфекциям, вызванным другими микроорганизмами. У больных животных наблюдается потеря аппетита, понос, нарастающая слабость, адинамия, учащенное и поверхностное дыхание, учащенный пульс, интоксикация, поражение центральной нервной системы - судороги, депрессия, чередующаяся с возбуждением. При затяжном течении болезни возникает обезвоживание организма, западание глазных яблок, истощение. У некоторых животных могут быть серозно-катаральные или серозно-гнойные истечения из носовой полости, хрипы в области бронхов и легких, конъюнктивит, артриты. Температура тела обычно в пределах нормы или повышена на 0,5-1,0°С, в предагональном состоянии - ниже нормы.

При кишечной форме возбудитель болезни локализуется в желудочно-кишечном тракте и мезентериальных лимфатических узлах; при септической - еще и в паренхиматозных органах, крови, костном и головном мозге и регионарных лимфатических узлах.

У взрослых животных клинические признаки болезни обычно отсутствуют. В отдельных случаях могут быть артриты, аборты, эндометриты, маститы и еще реже - диарея.

Основной путь заражения - алиментарный. Не исключается возможность инфицирования при контакте с больными животными, а также с ранее переболевшими животными и работниками животноводческих ферм - бактерионосителями. Выздоровевшие животные могут длительное время оставаться бактерионосителями и выделять возбудителя болезни в окружающую среду.

У животных-бактерионосителей клинические признаки отсутствуют. У крупного рогатого скота иерсинии встречаются в кишечнике, у свиней - на слизистой корня языка, миндалинах глотки, в подчелюстных лимфатических узлах, у лактирующих животных - в молоке.

1.4. Патологоанатомические изменения у погибших от иерсиниоза животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита с наличием точечных, пятнистых и полосчатых кровоизлияний на слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника; мезентериальные лимфатические узлы увеличены, на разрезе розово-красного или вишневого цвета. В брюшной полости может содержаться серозный экссудат светло-желтого цвета. Селезенка иногда имеет утолщенные края или слегка увеличена с точечными кровоизлияниями под капсулой; печень нередко перерождена, глинистого цвета, пульпа на разрезе имеет дряблую консистенцию и легко снимается при соскобе.

В почках под капсулой могут быть точечные кровоизлияния. На разрезе граница коркового и мозгового слоев в ряде случаев сглажена. На эпи- и эндокарде в области клапанов сердца часто отмечаются точечные и пятнистые кровоизлияния. Легкие могут иметь мраморный рисунок с наличием лобарной пневмонии. В бронхах и трахее - пенистый экссудат. Сосуды головного мозга сильно гиперемированы, мозговая ткань отечна.

Указанные изменения наблюдаются в отдельных или одновременно в нескольких органах.

1.5. Диагноз иерсиниоза у животных ставят на основании результатов бактериологического и молекулярно-генетического исследования (ПЦР) с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков болезни и патологоанатомической картины.

1.6. При убое и разделке туш животных-бактерионосителей может происходить контаминация иерсиниями мяса этих животных и получаемых от них субпродуктов в результате загрязнения частицами фекалий, помета птиц, содержимого кишечника, через режущие необеззараженные инструменты, тару и пр.

У лактирующих животных-бактерионосителей иерсинии могут содержаться в молоке и приготовленных из него сливках или попадать в молоко с контаминированной поверхности молочной железы во время доения коров, необеззараженных доильного оборудования и молочной посуды.

1.7. Возможность контаминации различных растений, корнеплодов, злаковых и бахчевых культур иерсиниями обусловлена способностью этих бактерий продолжительное время выживать и размножаться при температуре от +4 до +40°С в воде и влажной почве, богатой органическими веществами. В связи с этим растительные культуры и приготовленные из них салаты и корма могут быть источником заражения людей и животных патогенными штаммами иерсинии. Установлено, что в период вегетации растений, выросших на почвах, в которые попадают сточные воды с животноводческих ферм, иерсинии проникают внутрь растений. И хотя в таких случаях в смывах с овощей указанные бактерии не удается обнаружить, но при измельчении зеленой массы из выделяемого сока может быть выделена культура иерсиний.

     2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

2.1. Целью бактериологического исследования материала на иерсиниоз является выделение чистой культуры возбудителя болезни с изучением ее морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств и определение патогенности в пластинчатой РА с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки к патогенным штаммам иерсиний (СПИ), входящей в состав "Тест-системы для идентификации патогенных штаммов Yersinia enterocolitica".

2.2. Взятие материала и пересылка его для лабораторного исследования

2.2.1. Для прижизненной диагностики иерсиниоза в лабораторию направляют материал от больных животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами, отобранный в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками:

а) фекалии в количестве 2-3 г, отобранные непосредственно из прямой кишки с помощью предварительно прокипяченного резинового катетера или в момент дефекации;

б) молоко в количестве 10-15 мл, взятое выборочно от 15-20 коров стада после санитарной обработки молочной железы и сдаивания первых порций молока - одна сборная проба. В зависимости от поголовья коров на ферме количество сборных проб молока может варьировать в пределах от 3 до 5. Молоко должно быть доставлено в лабораторию для исследования в день взятия пробы. При отсутствии такой возможности молоко консервируют кристаллической борной кислотой (0,1 г на 10 мл). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.2. Для посмертной диагностики в лабораторию направляют материал от погибших или вынужденно убитых животных, желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

Трупы мелких животных (поросят, пушных зверей, птиц и др.) направляют целиком (2-4 тушки).

От крупных животных посылают следующий материал: сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты; селезенку; долю печени с желчным пузырем; почку; пораженные участки тонкого или толстого отдела кишечника с содержимым, перевязанные с двух концов лигатурой, вместе с регионарными мезентериальными лимфатическими узлами (в отдельной посуде или полиэтиленовом пакете); голову; трубчатую кость; подчелюстные лимфатические узлы; у свиней и поросят еще и соскобы с задней стенки глотки, с поверхности корня языка и глоточных миндалин, взятые стерильным скальпелем.

2.2.3. Для диагностики иерсиниоза птиц из неблагополучных секций птичника направляют по 3-5 свежих трупов или 3-5 птиц с клиническими признаками диареи. Больную птицу убивают в лаборатории и подвергают патологоанатомическому и бактериологическому исследованию.

2.2.4. Пробы мясного сырья, молока и сливок для бактериологического исследования отбирают согласно правилам и в количествах, предусмотренных следующими ГОСТами:

- мясо - ГОСТ 7269-79. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести;

- мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи - ГОСТ Р 50396.0-92. Методы отбора проб и подготовка их к микробиологическим исследованиям;

- молоко и сливки - ГОСТ 13928-84. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу.

2.2.5. Корнеплоды, хранящиеся в овощехранилищах или буртах, подвергают исследованию не ранее чем через 30 дней после их закладки. Пробы растительных кормов для исследования на наличие в них бактерий вида Yersinia enterocolitica отбирают согласно следующим ГОСТам:

- корма растительного происхождения - ГОСТ 27662-87*. Методы отбора проб (зеленый корм, сено, силос, сенаж);

________________  

* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 27262-87. - Примечание изготовителя базы данных.

- комбикорма, сырье - ГОСТ 13496.0-80. Методы отбора проб (кормовая мука, травяная мука, сушеный свекловичный жом, сухие кукурузные корма и т.д.);

- картофель свежий продовольственный - ГОСТ Р 51808-2001. Методы отбора проб;

- свекла столовая, кормовая свежая - ГОСТ Р 1811-2001*.

________________

*  Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ Р 51811-2001. - Примечание изготовителя базы данных.

2.2.6. Пробы материала, отобранные для бактериологического исследования, упаковывают в полиэтиленовые пакеты или во влагонепроницаемую тару и в тот же день направляют в лабораторию. Если материал (органы, ткани и фекалии животных) доставить в лабораторию в течение 3-4 ч не представляется возможным, особенно в теплое время года, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина, объем которого должен превышать объем материала в 2-3 раза.

СХЕМА бактериологического исследования патологического материала на иерсиниоз

2.3. Исследование материала

2.3.1. Присланный в лабораторию материал исследуют в день его поступления, соблюдая правила асептики.

2.3.2. Для выделения иерсиний из исследуемого материала используют жидкую селективную среду обогащения - И-бульон, разлитый в пробирки в количестве 4-5 мл, и одну из плотных дифференциально-диагностических или селективных сред, разлитую в чашки Петри и подсушенную в течение 40-60 мин в термостате: - И-агар; селективные среды для выделения иерсиний компании "HiMedia Laboratories Limited" или фирмы "OXOID" - СМ 653; агар Эндо; среду с желчью и индикатором бромтимоловым синим - СБТС; или среду для выделения иерсиний (г.Махачкала).

2.3.3. Пробы фекалий и соскобы со слизистой кишечника, корня языка и заглоточных миндалин (две последние пробы можно объединить) в количестве приблизительно 0,5 г переносят в пробирки с 8-10 мл стерильного физиологического раствора и суспендируют. Взвесь отстаивают при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Надосадочную жидкость после оседания крупных частиц в количестве 0,2-0,4 мл высевают в И-бульон в пробирке.

В тех случаях, когда пробы фекалий консервированы глицериновым раствором, последний сливают и 0,5 г фекалий разводят физиологическим раствором, последующее исследование проводят, как указано выше.

2.3.4. Из печени, селезенки, почки, лимфатических узлов вырезают ножницами кусочки размером не менее 1-1,5 мл, увлажняют спиртом, обжигают поверхность до сгорания спирта, после чего помещают в пробирки с 3-5 мл стерильного физиологического раствора, суспендируют и высевают взвесь по 0,2-0,3 мл в И-бульон в пробирке.

Внутренние органы можно исследовать и другим образом. Поверхность органа прижигают раскаленным шпателем. Стерильной пастеровской пипеткой в участке фламбированной поверхности отсасывают ткань в объеме 0,2-0,3 мл и высевают ее в И-бульон в пробирке.

2.3.5. Кровь из сердца, желчь, головной и костный мозг отсасывают по 0,2-0,3 мл пастеровскими пипетками и вносят в пробирки с И-бульоном, которые встряхивают для перемешивания материала.

2.3.6. Для исследования мяса и субпродуктов из средней пробы материала отвешивают навеску в 25 г, нарезают ножницами на мелкие кусочки, последние растирают в стерильной фарфоровой ступке с небольшим количеством стерильного физиологического раствора или дистиллированной воды, затем суспензии переливают в колбы, встряхивают и отстаивают в течение 10-15 мин для осаждения крупных частиц, надосадочную жидкость переносят в колбу, содержащую 100 мл И-бульона и тщательно перемешивают.

2.3.7. Пробы мясного фарша, сырого молока и полученных из него сливок в количестве по 25 г вносят в колбы, содержащие 100 мл И-бульона, которые встряхивают в течение 2-3 мин с целью размешивания материала.

2.3.8. Для исследования овощей (корнеплодов) из сборной пробы делают навески по 0,5 кг, обмывают поверхность корнеплодов ватно-марлевыми стерильными тампонами, смоченными стерильным физиологическим раствором или дистиллированной водой, которые затем погружают в колбу со стерильным физиологическим раствором или дистиллированной водой в объеме 80-100 мл.

Содержимое колбы тщательно встряхивают в течение 4-5 мин, отстаивают 10-15 мин для осаждения крупных частиц грунта и вносят по 25 мл в колбы со 100 мл И-бульона.

2.3.9. Пробы растительных кормов отбирают в количестве 25 г, измельчают предварительно прокипяченными ножницами или ножом на мелкие кусочки и вносят в колбы со 100 мл И-бульона, закрывают стерильными резиновыми пробками и тщательно встряхивают в течение 10-15 мин вручную или на шуттель-аппарате.

2.4. Выделение и изучение культур иерсиний

2.4.1. Пробирки (колбы) с засеянным исследуемым материалом в И-бульоне инкубируют при температуре 30-32°С в течение 24 ч.

2.4.2. Культуры, полученные в И-бульоне, пересевают бактериологической петлей частыми широкими штрихами в отдельные чашки Петри с И-агаром или одной из плотных питательных сред (см. п.2.3.2) по всей поверхности агара или на отдельные секторы чашек, которые помещают в термостат на 48 ч.

2.4.3. Через 24-48 ч учитывают характер роста колоний, выросших в чашках Петри на поверхности одной из плотных питательных сред, визуально и с помощью лупы.

Селективные и дифференциально-диагностические среды для выделения иерсиний подавляют рост многих видов посторонней микрофлоры, однако это обстоятельство не исключает необходимость идентификации культур бактерий, подозрительных на иерсинии, по биохимическим свойствам.

Таблица 2.1

     
Характер роста Y. enterocolitica на различных средах

2.4.4. Типичные для иерсиний колонии отсевают на скошенный МПА (с каждой чашки 1-2 колонии), инкубируют при 22-25°С в течение 24 ч и затем проводят изучение морфологических, тинкториальных и биохимических свойств выделенных культур.