ГОСТ EN 14164-2014

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение витамина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Foodstuffs. Determination of vitamin B6 by high performance chromatography

МКС 67.050

Дата введения 2017-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским государственным предприятием "Казахстанский институт стандартизации и сертификации" Комитета технического регулирования и метрологии и Техническим комитетом по стандартизации ТК 71 "Экологическая безопасность сырья, материалов, веществ и сооружений" на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5     

2 ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 августа 2014 г. N 69-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 11 мая 2016 г. N 295-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14164-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14164:2008* "Продукты пищевые. Определение витамина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Foodstuffs - Determination of vitamin B6 by HPLC", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Европейский стандарт EN 14164:2008 подготовлен Техническим комитетом CEN/ТС 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Декабрь 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ). Витамин представляет собой сумму массовых долей пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, включая их фосфорилированные продукты замещения, в пересчете на пиридоксин. Они определяются по методу, указанному в [1], при помощи которого могут быть разделены и количественно определены как индивидуальные соединения - различные витамеры витамина (пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин). В [2] определяется общее содержание витамина микробиологическим методом.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт:

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

     3 Сущность метода

Пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин извлекают из продуктов питания в ходе гидролиза в кислой среде и дефосфорилируют ферментативным путем, используя кислую фосфатазу. В результате реакции с глиоксиловой кислотой в присутствии в качестве катализатора пиридоксамин превращается в пиридоксаль, который далее переходит в пиридоксин под воздействием борогидрида натрия в щелочной среде.

Затем пиридоксин количественно определяют в растворе пробы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектором [3], [4].

     4 Реактивы

4.1 Общие положения

Для испытаний используют реактивы гарантированной чистоты и воду не ниже 1-й степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696.

4.2 Реактивы

4.2.1 Кислая фосфатаза из картофеля, ферментная активность составляет 33 нанокатал/мг* с субстратом нитрофенилфосфатом (при рН = 4,8 и температуре 37°С), например, производства Boehringer или Sigma. Активность 33 нанокатал/мг соответствует 2 U/мг.

_______________

* Катал (обозначается "кат") - единица измерения активности катализатора в системе СИ. Активность катализатора в один катал увеличивает скорость реакции на один моль/с в заданных условиях.

4.2.1.1 Раствор кислой фосфатазы

Готовят раствор кислой фосфатазы в растворе ацетата натрия (см. 4.2.14) массовой концентрации 20 мг/см.

Необходимо использовать кислую фосфатазу, а не Така-диастазу для достижения полного гидролиза фосфорилированных форм витамина . Там, где требуется 300 мг Така-диастазы для получения хорошего дефосфорилирования, кислой фосфатазы потребуется всего 0,5 мг (см. [5]).

4.2.1.2 Проверка активности кислой фосфатазы

Проверяют активность каждой новой партии кислой фосфатазы следующим образом. Готовят исходный раствор пиридоксальфосфата массовой концентрации 0,1 мг/см (см. 4.2.9) в воде. Отбирают для экстракции 5,0 см этого раствора и проводят операции, предусмотренные в 6.2.1, 6.2.2, 6.2.3, 6.2.4 и 7.

Рассчитывают коэффициент извлечения пиридоксина из этого раствора и делят на теоретическое количество пиридоксина, выделенного из пиридоксальфосфата. Вычисляют теоретическую массовую концентрацию пиридоксина , мг/см, выделенного из пиридоксальфосфата по формуле:

,                                       (1)

где - массовая концентрация пиридоксальфосфата, определенная спектрофотометрическим методом в УФ-области;

- молярная масса образца сравнения витамина - пиридоксина (169,1), г/моль;

2 - коэффициент разбавления при реакции с борогидритом натрия;

5,0 - объем раствора, взятого для экстракции (см. 4.2.1.2), см;

100 - общий объем исследуемого раствора пробы, см;

- молярная масса пиридоксальфосфата (265,16), г/моль.

Смешивают 3,0 см исходного раствора пиридоксальфосфата и 10 см соляной кислоты (см. 2.21) в мерной колбе вместимостью 20 см и разбавляют до метки водой. Проверяют концентрацию пиридоксальфосфата путем измерения поглощения при 295 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя спектрофотометр для УФ-области спектра (см. 5.2) относительно раствора соляной кислоты (см. 4.2.20). Молярный коэффициент поглощения () пиридоксальфосфата в растворе соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм равен 8353.

Рассчитывают массовую концентрацию исходного раствора пиридоксальфосфата , мг/см, по формуле:

,                                          (2)

где - оптическая плотность раствора при 295 нм;

- молярная масса пиридоксальфосфата (265,16), г/моль;

- коэффициент разбавления (в данном случае 20/3);

- молярный коэффициент поглощения пиридоксальфосфата в 0,1 моль/дм соляной кислоты при 295 нм, дммольсм (8353).

4.2.2 Ацетат натрия трехводный (тригидрат), с массовой долей ()99,0%.

4.2.3 Ледяная уксусная кислота, с массовой долей ()99,8%.

4.2.4 Глиоксиловая кислота, с массовой долей ()97,0%.

4.2.5 Сульфат железа (II) 7-водный (гептагидрат), с массовой долей ()99,5%.

4.2.6 Гидроксид натрия, с массовой долей (NaOH)99,0%.